細胞培養從頭學
一、常用設備
1. 準備室的設備：
單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未消毒物品）、儲品柜（放置消毒過的物品）、包裝臺。配液室的設備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計（測量培養用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。
2. 培養室的設備：
液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統、低溫冰箱（-80℃）、空調、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。
3. 必須放在無菌間的設備：
離心機（收集細胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4℃冰箱（放置serum和培養用液）。
 
二、無菌操作
（一）無菌室的滅菌：
1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰來蘇爾或新潔爾滅或0.5％過氧乙酸擦拭。
2.CO2孵箱（培養箱）滅菌：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過氧乙酸，再用紫外燈照射。
3.實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統各20-30分鐘。
4.實驗后滅菌：用75％酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。
（二）實驗人員的無菌準備：
1.肥皂洗手。
2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋。
3.用75％酒精棉球擦凈雙手。
（三）無菌操作的演示：
1.凡是帶入超凈工作臺內的酒精、PBS、培養基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。
2.靠近酒精燈火焰操作。
3.器皿使用前必須過火滅菌。
4.繼續使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。
5.各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。
6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。
 
三、器械的清洗和消毒
（一）玻璃器械洗消：
新的玻璃器皿的洗消：
1.自來水刷洗，除去灰塵。
2.烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。
3.刷洗、烘干：12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時，然后從酸缸內撈出器皿用自來水沖洗15次，**后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過3次。
5.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。
6.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內蓋好蓋子，打開開關和安全閥，當蒸氣成直線上升時，關閉安全閥，當指針指向15磅時，維持20-30分鐘。
7.高壓消毒后烘干
舊的玻璃器皿的洗消：
1．刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時后從酸缸內撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。
3.烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。
4.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內，蓋好蓋子，打開開關和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當蒸氣成直線冒出3-5分鐘后，關閉安全閥，氣壓表指數隨之上升，當指針指向15磅時，調節電開關維持20-30分鐘即可。（玻璃培養瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）
5.烘干備用：因為高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內烘干備用。
（二）金屬器械洗消：
金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75％酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內包裝好在高壓鍋內15磅高壓（30分鐘）消毒，再烘干備用。
（三）橡膠和塑料：
橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據不同品質進行如下的處理程序：
1. 針式濾器帽不能泡酸液，用NaOH泡6-12小時，或者煮沸20分鐘，在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內15磅30分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺內取出使用時應該立即將螺旋旋緊。
2. 膠塞烘干后用2％氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。**后裝入鋁盒內高壓消毒，烘干備用。
3. 膠帽，離心管帽烘干后只能在2％氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時（切記時間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。**后裝入鋁盒內高壓消毒，烘干備用。
4. 膠頭可用75％酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。
5. 塑料培養瓶，培養板，凍存管：
6. 其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培養皿打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周時間洗除殘留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射線消毒塑料制品效果**好。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號，平時這種墨水不帶痕跡，一經高溫，即出現字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制：氯化鉆(CoC12•6H2o)2g，30％鹽酸10m1，蒸餾水88m1。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
 
注意事項：
1.嚴格執行高壓鍋的操作規程：高壓消毒時，先檢查鍋內是否有蒸餾水，以防高壓時燒干，水不能過多因為其將使空氣流暢受阻，會降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時爆炸。
2.安裝濾膜時注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。
3.注意人體的防護和器皿的完全浸泡：A.泡酸時要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內撈取器皿時防止酸液濺到地面，會腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。
 
四、細胞培養用液的配制與消毒
器材與試劑：干粉型培養基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統、電子天平、PH計、磁力攪拌器。
具體步驟：
（一）水的制備：
細胞培養用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水
（二）PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：
1.溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•H2O 1.56g，KH2PO40. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準確定容**1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。
2.移入溶液瓶內待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發掉的水份。
（三）胰蛋白酶溶液的配制與消毒：
胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關，在pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力**強。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。
1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內過夜。
2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。
（四）青、鏈霉素溶液的配制于消毒
1.所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。
2.具體操作均在超凈臺內完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。
3.使用時溶入培養液中，使青鏈霉素的濃度**終為100單位/ml。1單位＝1微克？
（五）RPMI1640的制備與消毒：
1.溶解、調PH值、定容：先將培養基粉劑加入培養液體積2/3的雙蒸水中，并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養基中)，充分攪拌**粉劑全部溶解，并按照包裝說明添加一定的藥品。然后用注射器向培養基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml，使青鏈霉素的濃度**終各為100單位/ml。然后用一個當量的鹽酸和NaOH調PH到7.2左右。**后定容**1000ml，搖勻。
2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。
3.抽濾：配制好的培養液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內過濾。
4.分裝：將過濾好的培養液分裝入小瓶內置于4℃冰箱內待用。
5.使用前要向100ml培養液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時兩周有效）。
（六）血清的滅活：
細胞培養常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后，再經過抽濾方可加入培養基中使用。
（七）HEPES溶液：
HEPES的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養液內含20mmol/LHEPES即可達到緩沖能力。
1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：準確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容**1L。過濾除菌，分裝后4℃保存。注意：因為現在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據實際情況靈活配制，但是要保證培養液內HEPES的終濃度仍然為20mmol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養液中，或者每100ml培養液中加入2ml即可。
（八）谷氨酰胺：
合成培養基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚**死亡。在配制各種培養液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定，4℃下放置1周可分解50％，故應單獨配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養液。加有谷氨酰胺的培養液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L?？梢耘渲?00mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加**100ml即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養液中加入1ml谷氨酰胺溶液。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
（九）肝素溶液的配制：
含有肝素的培養液可以使內皮細胞純度提高，肝素加入全培養液中**終濃度為50ug/ml。因為現在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為℃。使用時，向100ml培養液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。
（十）Ⅰ型膠原酶：
0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。
（十一）明膠溶液：
因為明膠難于過濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。shou要的問題是如何無菌準確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是0.1的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中， 4℃保存。
（十二）其他培養用液的配制：
20ug/ml內皮生長因子
 
注意事項：
1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。
2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米 和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。
3.配制RPMI1640培養基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養液PH值**終為7.2，可在配制時調PH**7.4。
 
五、細胞傳代培養（消化法）
具體操作：
（一）傳代前準備：
1.預熱培養用液：把已經配制好的裝有培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。
2.用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。
3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。
4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。
5.準備好將要使用的消毒后的空培養瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次消毒。？？？
6.取出預熱好的培養用液：取出已經預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。
7.從培養箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。
8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。
（二）胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：小心吸出舊培養液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞**好，**佳消化溫度是37℃。
2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。
3.吸棄消化液加入培養液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養液。
（三）吹打分散細胞：
1.吹打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。
2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。
3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉/分鐘離心6-8分鐘。
4.棄上清液，加入新培養液：棄去上清液，加入2ml培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。
（四）分裝稀釋細胞：
1.分裝：將細胞懸液吸出分裝**2-3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。
2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml。**后要做好標記。
（五）繼續培養：
用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養瓶底面積25％時為一個＋，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋。
 
傳代細胞培養注意事項：
1.嚴格的無菌操作
2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
 
附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容**1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時調節PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養瓶要徹底清洗，否則再培養時細胞容易脫壁。
 
六、細胞的復蘇
細胞復蘇的原則——快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化**37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。
具體操作
（一）實驗前準備：
1.將水浴鍋預熱**37℃
2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。
3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等等。
（二）取出凍存管：
1.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。
2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。
（三）迅速解凍：
1.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
（四）平衡離心：
用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3min
（五）制備細胞懸液：
1.吸棄上清液。
2.向離心管內加入10ml培養液，吹打制成細胞懸液。
（六）細胞計數：
細胞濃度以5×105/ml為宜。
（七）培養細胞
將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃和5％CO2的培養箱內2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續培養培養，換液的時間由細胞情況而定。
 
初學者易犯錯誤：
1水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。
2.水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。
3.離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。
4.一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。
 
七、細胞計數
實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。
具體操作：
（一）準備工作：
取一瓶傳代的細胞，按照《傳代細胞培養（消化法）》中的傳代方法繁殖細胞，待長成單層后以被使用。
（二）細胞懸液制備：
細胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細胞懸液。
（三）細胞計數：
1.蓋好蓋玻片：取一套血球計數板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上。
2.制備計數用的細胞懸液：用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍染液（0.4％）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞。
3.將細胞懸液滴入計數板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。
4.統計四個大格的細胞數：將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，當看到鏡中出現計數方格后，數出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數目。
5.計算原細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度：
（細胞懸液的細胞數）/ml＝ （ 四個大格子細胞數/4) ×2×104
說明：公式中除以4因為計數了4個大格的細胞數。
公式中乘以2因為細胞懸液于染液是1：1稀釋。
公式中乘以104因為計數板中每一個大格的體積為：
1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3
（四）細胞計數要點：
1.進行細胞計數時，要求懸液中細胞數目不低于104個/ml，如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養液中；
2.要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。
3.取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確；
4. 數細胞的原則是只數完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。
5. 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。
（五）初學者易犯的錯誤：
1. 計數前未將待測懸液吹打均勻。
2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。
3. 滴入懸液時的量太多，**使細胞懸液流入旁邊的槽中。
（六）本實驗特殊試劑的配制：
4％臺盼藍母液：稱取4克臺盼藍，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水**100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。
使用液：使用時，用PBS稀釋母液**0.4％即可。
 
八、細胞的凍存
1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。
2.接著置于-20℃冰箱，約30-60min。
3.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。
4.置于液氮罐中長期保存。
5同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。
注意事項：
1.使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破壞它的分子結構，以**于降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時**好戴上手套操作。
2.不宜將凍存細胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內過久，低溫損傷主要發生在這一溫度區內，是“危險溫區”。
3.注意定期檢查液氮罐內液氮量，及時添加。